中药复方消癌根对肿瘤生长的影响

时间
2006-04-24

材料与方法

(一)实验动物

昆明种小鼠60只,4~6周龄,体重18~22g,雄性,购自南方医科大学动物中心。实验前分笼饲养适应环境1周,实验过程中动物自由摄食、饮水,鼠房保持通风,室温保持在25±2℃,光照周期12/12小时。

(二)细胞株

细胞株为小鼠腹水型肝癌细胞株S180细胞,皮下接种可生成肉瘤。购于中山医科大学肿瘤研究所,常规复苏传代培养。

(三)主要药物、试剂和仪器

中药复方消癌根,由董草原医生提供。

环磷酰胺,江苏恒瑞医药股份有限公司生产,批号02071121。

(四)消癌根药液的制备

消癌根是由纯中药粉碎而得的黑褐色药粉。根据人与小鼠药物剂量换算公式:d小鼠=d人×(k小鼠/k人),(k小鼠、k人分别为小鼠和人的折算系数)算出小鼠每日给药剂量。取体重为50kg正常成人每日口服消癌根剂量为9g,算得小鼠每日给药低剂量,再将其剂量增加一倍设为高剂量;然后算出药液所要浓度。用蒸馏水将消癌根分别配成每毫升含0.10g、0.05g生药的高、低两个剂量组的悬浊液,4℃冰箱保存,用时摇匀。

用无菌生理盐水将环磷酰胺稀释成为2mg/ml,4℃冰箱保存。

(五)荷瘤小鼠模型的建立

体外复苏培养S180细胞:将S180细胞培养于含体积分数为10%小牛血精的RPMI-1640营养液(含青霉素100×103?滋/L和链霉素100mg/L)中,置于37℃、含5%CO2的培养箱内。该细胞呈贴壁生长,取指数生长期的细胞,用0.5%胰蛋白酶消化,机械吹打成细胞悬液,PBS洗涤2次,2000r/min离心5min,弃上清液,用无菌生理盐水稀释,调整到2×106/ml~3×106/ml个瘤细胞,随机先取5只健康昆明种小鼠,每只用上述细胞悬液0.4ml腹腔注射,注意观察接种小鼠腹水生长情况,约1周后接种小鼠腹部明显增大、凸出。将其颈椎脱臼处死,固定于蜡板上,无菌抽取乳白色腹水液,以0.9%氯化钠溶液1:1稀释,经0.2%台盼蓝染色后计算活细胞数﹥95%,调整瘤细胞悬液浓度为6×106/ml个瘤细胞,每只小鼠右后肢臀部皮下接种0.2ml。共接种44只小鼠。24小时后用药。

(六)实验分组和给药

将44只造模成功的小鼠随机分为4组,每组11只,组内编号。4组分别为:消癌根高剂量组、消癌根低剂量组、阴性对照组及环磷酰胺组。所有处理自造模第二天开始:消癌根高、低剂量组分别按24g·kg-1·d-1、2g·kg-1·d-1灌胃,阴性对照组给相同剂量的蒸馏水灌胃,环磷酰胺组按20mg·kg-1·d-1腹腔注射。连续用药15天后停药,处死小鼠,剥离瘤块,用滤纸吸干后,称取瘤重。

(七)评定指标

(1)肿瘤抑制百分率(抑瘤率):

抑瘤率(%)=(阴性对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/(阴性对照组平均瘤重)×100%

(2)给药期间,每隔3天用游标卡尺由体外测出瘤体的长径和短径,然后根据体积=长径×短径2,绘出肿瘤生长图。

(八)统计学处理

实验结果用均数±标准差(X±s)表示,实验资料采用SPSS10.0统计软件包处理。

结 果

(一)瘤重和抑瘤率

消癌根对S180移植性肿瘤的抑制作用。消癌根高剂量组和消癌根低剂量组与阴性对照组比较,其瘤重均显著减轻(P﹤0.05);消癌根高剂量组的瘤重与消癌根低剂量组比较亦明显减轻(P﹤0.05);消癌根高剂量组与环磷酰胺组比较其瘤重有显著性差异(P﹤0.05);环磷酰胺组抑瘤率最高。

(二)肿瘤的生成曲线

以时间为横轴,肿瘤体积为纵轴绘制肿瘤的生长曲线。

讨论

(一)小鼠腹水型肝癌细胞株S180细胞的选择

国内研究者对S180生物学特性、免疫学、细胞系的建立及移植实验条件等方面做了较为深入的研究。由于其造模时间短、接种成功率高的特点,均一性好,目前此模型已广泛地用于肿瘤基础研究及药物筛选,成为研究中医药抗肿瘤的作用及机制的一个公认的肿瘤模型。

本实验采用购自中山医科大学肿瘤研究所的S180细胞,进行小鼠皮下肿瘤造模。经过对S180细胞的复苏、传代,右后肢臀部皮下接种,成功地造出44只荷瘤小鼠,造模成功率达100%。这一模型具有明显外部特征,容易观察、测量皮下瘤块的生长情况,以反映出各实验组的药效。另外,本实验中的荷瘤小鼠皮下肿瘤易剥离,以便较为精确地称重、计算抑瘤率。

(二)消癌根对肿瘤的抑制作用

本实验拟考察消癌根的抗肿瘤效果,以S180荷瘤小鼠为实验对象,将环磷酰胺设为阳性对照药,生理盐水组作为阴性对照组进行操作。环磷酰胺是临床常用的化疗药,其能有效地杀伤癌细胞(本实验其抑瘤率达到45.6%)。药效方面,消癌根高剂量组抑瘤率达到35.2%,消癌根低剂量组亦达到22.1%,消癌根高剂量组平均瘤重与低剂量组平均瘤重存在显著性差异(P﹤0.05)。这说明消癌根在抗肿瘤方面有一定疗效,并且存在着一定的量效趋势。

消癌根的抗肿瘤机理可能是通过抑制捐资血管生成来实现的。将在以下实验中予以探讨。